色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等。

　　在二手液相色谱仪定量分析中，分离开是首要要求。基线分离是提供结果的有效保障。含有5个组分或更少的样品，使谱峰之间达到基线分离一般较为容易。分离度会随色谱柱的使用时间逐步降低，也会由于分离条件的微小波动而在不同时间有所变化，因此在建立简单混合物的分离方法时，使R≥2。这样的分离度将有利于改善测试精度和方法的普适性；含10团种或10种以上组分的样品，分离一般会很困难，目标分离度往往必须降低至R＞1.0—1.5。

　　有些HPLC测定不必使全部被测组分达到基线分离，这种情况常见于所测样品中可能存在数种化合物但仅需检测其中的一种时。比如在普查水或土壤样品中的某污染物时，仅需要分离出个别除莠剂，确定其特征保留时间进行峰鉴别即可。

　　尽管大多数HPLC设备能在更高的压力下工作，使用新色谱柱的工作压力不应超过170bar，压力上限在2000psi以下。限制该压力基于两点原因：

　　，随着色谱柱的使用，微粒杂质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；

　　第二，较低的压力适于泵、进样阀、尤其是自动进样装置的稳定工作，密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提高。因此，以小于泵的zui大允许压力的50%作为目标压力。